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重组人胰岛素类似物的HPLC分析丝印台

发布时间:2022-08-13 12:31:38 来源:得力五金网

重组人胰岛素类似物的HPLC分析

重组人胰岛素类似物的HPLC分析 2011: 目的:探讨HPLC分析在重组人胰岛素类似物鉴别和杂质检测 中的适用性。方法:采用反相色谱柱(C18),以硫酸钠-磷酸缓冲液( 0.2 mol.L-1,pH 2.3)和乙腈为流动相,流速0.8或1.0 mL.min-1,柱 温40 ℃,检测波长214 nm;用分子筛柱(Zorbax GF250)以磷酸铵缓冲液(0.1 mol.L -1,pH 7.5)和乙腈为流动相,流速0.5 mL.min-1,检测波长214 nm;检测 重组人胰岛素类似物及其酶解片段。结果:获得胰岛素及其类似物的RP-HP LC图谱,肽图谱和高效体积排阻色谱(HPSEC)图。结论:本文方法能够有效 地区 别和检测胰岛素类似物及有关物质,为该类药物的质控提供了科学依据。

关键词 重组人胰岛素类似物 肽图谱 反相高效液相色谱 高效体积 排阻色谱

重组人胰岛素类似物(rhInsulin lispro)是重组人胰岛素分子B链上第28位的脯氨酸和 第29位的赖氨酸位置互换产物。其降血糖作用更迅速。临床上作为快速降糖药物,其制剂的 商品名为优泌乐(HumalogTM),该药已被FDA批准上市,并进口我国。在药品检验中, 如何区分一级结构仅有微小差别的人胰岛素和人胰岛素类似物,本文试用RP-HPLC法和H PSEC法对其分子或酶解片段进行了分析。

1 仪器与材料

1.1 仪器 岛津LC-10AD泵、CTO-10A柱温箱、SPD-10A检测器 、DGU-4A脱气机、C-R7Ae plus积分仪。

1.2 材料 重组人胰岛素类似物(rhInsulin lispro)对照品及 其注射液(HumalogTM)、B30脱苏氨酸重组人胰岛素由美国Elilly公司提供;重 组人胰岛素对照品、重组人胰岛素-A21脱氨人胰岛素对照品、猪胰岛素-A21脱 氨猪胰岛素对照品、重组人胰岛素类似物单体-二聚体对照品(中国药品生物制品检定所); 重 组人胰岛素为国产原料;V8蛋白酶为Sigma产品;乙腈为色谱纯试剂,其它试剂均为国产 分析纯。

2方法与结果

2.1 肽图谱 测定 取重组人胰岛素类似物对照品、重组人胰岛 素对照品和B30脱苏氨酸重组人胰岛素适量,用0.1%的三氟乙酸溶液制成每1 mL中含 10 mg的溶液;取20 μL,加0.2 mol.L-1 Tris-盐酸缓冲液(pH 7.3)20 μL,0. 1% V8蛋白酶溶液20 μL,水140 μL,混匀,置37 ℃水浴2 h后,加85%的磷酸溶液3 μL 终止反应,作为酶解样品溶液;另取重组人胰岛素类似物对照品、重组人胰岛素对照品和B 30脱苏氨酸重组人胰岛素适量,以水代替V8蛋白酶同法制备非酶解样品溶液。采 用Vydac Protein and Peptide C18色谱柱(250 mm×4.6 mm);柱温40 ℃;流速1. 0 mL.min-1;检测波长214 nm;以0.2 mol.L-1硫酸盐缓冲液(pH 2.3) [1]-乙腈(90∶10)为流动相A,乙腈-水(50∶50)为流动相B;进行梯度洗脱。初始状 态为10%B,5 min时流动相B增至20%,45 min时流动相B增至60%,保持5 min。取上述酶解样 品溶液和非酶解样品溶液各20 μL分别注入液相色谱仪,记录色谱图。肽图谱见图1。(略)

1.重组人胰岛素类似物酶解样品

2.B30脱苏氨酸重组人胰岛素酶解样品

3.重组 人胰岛素酶解样品

4.重组人胰岛素非酶解样品

5.重组人胰岛素类似物 非酶解样品Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ—人胰岛素酶解片段代号

2.2 RP-HPLC鉴别 取重组人胰岛素-A21脱氨人胰岛素 对照品、牛胰岛素、猪胰岛素-A21脱氨猪胰岛素对照品和重组人胰岛素类似物对照品 适量,各用0.01 mol.L-1盐酸溶液分别制成每1 mL中含2.8 mg的溶液,取上述4种 溶液等体积混合,制得混合样品溶液;采用Spherisorb ODS Ⅱ(100 mm×4.6 mm)色谱柱; 流速0.8 mL.min-1;柱温40 ℃;检测波长214 nm;以0.2 mol.L-1硫酸盐 缓冲液(pH 2.3)-乙腈(75∶25)为流动相。分别取各种胰岛素溶液和混合样品溶液各20 μL 注入液相色谱仪,记录色谱图,确定不同保留时间对应的成分,各种胰岛素混合物的RP-HPL C图谱见图2。(略)

2.3 RP-HPLC分析重组人胰岛素类似物及有关物质 取A21 脱氨人胰岛素类似物对照品适量,用0.01 mol.L-1盐酸溶液制成每1 mL中含3.5 mg的溶液作为系统适用性样品溶液;取重组人胰岛素类似物注射液,用0.01 mol.L -1盐酸溶液调pH约为5.3时,其中重组人胰岛素类似物形成白色沉淀,4 000 g离心1 0 min,取上清液作为空白注射液;采用Vydac Protein and Peptide C18色谱柱(250 m m×4.6 mm);柱温40 ℃;流速1.0 mL.min-1;检测波长214 nm;以0.2 mol.L -1硫酸盐缓冲液(pH 2.3)-乙腈(82∶18)为流动相A;0.2 mol.L-1硫酸盐缓 冲液(pH 2.3)-乙腈(50∶50)为流动相B,洗脱梯度初始状态流动相B为19%,保持60 min, 在23 min内流动相B增至49%,保持5 min。取上述样品溶液和重组人胰岛素类似物制剂空白 各20 μL注入液相色谱仪,记录色谱图,重组人胰岛素类似物及有关物质的HPLC图谱见图3 。(略)

2.4 HPSEC分析 取重组人胰岛素类似物原料、重组人胰岛素 类似物制剂、重组人胰岛素类似物单体-二聚体对照品用流动相制成浓度为每1 mL约含0.7 mg(20 U)的溶液。采用Zorbax GF250 Special(25 cm×9.4 mm)分析色谱柱;以0.1 mol. L-1磷酸铵缓冲液(pH 7.5)-乙腈(65∶35)为流动相;流速0.5 mL.min-1; 检测波长214 nm。取上述样品溶液20 μL注入液相色谱仪,记录色谱图。重组人胰岛素类似 物及聚合物的HPSEC图谱见图4。(略)

3 讨论

3.1 鉴别 重组人胰岛素类似物的分子结构如图5所示。实验中使用的V8蛋白酶能专一裂解谷氨酸的 羧基端肽键。在非还原条件下,用V8酶水解重组人胰岛素类似物分子,理论上可产生4个 片段,即Ⅰ(A5-17与B1-13)、Ⅱ(A18-31与B14-21)、Ⅲ(B22-30)、Ⅳ(A1-4)。而在本实验条 件下,则多了一个中间片段,即Ⅴ(A1-17与B1-13),这是片段Ⅰ和Ⅳ聚合的结果[2] 。由图1可见,人胰岛素和B30脱苏氨酸人胰岛素以及重组人胰岛素类似物的酶解片 段Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ和Ⅴ的保留时间是相同的,分别为1 460、730、220和1 600 s,但片段Ⅲ的保 留时间则有差别,分别为660和550以及630 s。由此可见,通过肽图谱分析鉴别胰岛素类似 物是非常有效的。由图2可见,本文的RP-HPLC方法能有效地区分人、猪、牛胰岛素和重组人胰岛素类似物。此 法快速、不受其它成分干扰。

3.2 杂质分析 重组人胰岛素类似物在高温高湿度条件下,易 产生高分子量蛋白(HMWP),如在40 ℃,75%相对湿度下,HMWP的增加速率为每天0.16%;而 在酸性条件下,易形成脱氨产物,如其酸性溶液在室温放置时,A21脱氨重组人胰岛 素类似物的增加速率为每天0.6%[3]。本文据此制备系统适用性样品,在RP-HPLC 线性梯度洗脱分析中,重组人胰岛素类似物与其A21脱氨产物的分离度为2.6,按重 组人胰岛素类似物峰计算,其理论塔板数为5 350(见图3);而在HPSEC分析中,分离度以二 聚体峰高与单体和二聚体间的峰谷高之比表示,其值应大于2.0,按重组人胰岛素类似物单 体峰计算,其理论塔板数为6 200(见图4)。

综上所述,本文方法能有效地区分人、牛、猪胰岛素与人胰岛素类似物,能检测分离人胰岛 素类似物及有关物质和高分子量蛋白。结果为该类药物的质控提供了科学依据。

参考文献

1,中国药典2000年版起草标准.重组人胰岛素

2,Charles L Hershbergeret.Genetics and Molecular Biology of Industrial Microorganisms.Ed American Society for Microbiology,1989.322

3,Insulin lispro进口注册标准

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